Kirken blev påbegyndt i 1630’erne på en grund som var købt til formålet i 1622. Kong Christian den 4. var på denne tid i færd med at udbygge Københavns Universitets bygninger, og ville også opføre en kirke for de ansatte og studenterne overfor Regensen.
Grundstenen blev lagt i 1637, men kirken var først færdig i 1652. Tårnet var dog færdigbygget i 1642.
Kirken blev viet til den hellige treenighed (trinitatis på latin): Faderen, Sønnen og Hellighånden.
Kirken er især kendt for sit markante tårn, Rundetårn. På grund af tårnets særlige funktion som astronomisk observatorium, kunne det ikke fungere som klokketårn. I stedet fik kirken et spir, hvor klokkerne sad. Spiret styrtede sammen og ned i kirken under branden i 1728, men blev erstattet at tre andre spir.
På kirkens loft blev der plads til Universitetsbiblioteket og i tårnet blev der indrettet et astronomisk observatorium. Biblioteket rummede desuden den kongelige bogsamling.
I 1861 blev både bibliotek og observatorium flyttet til Østervold omkring Rosenborg Slot.
Efter byggeriet i Ny København, som ikke fra starten fik nogen sognekirke, blev Trinitatis kirke almindelig kirke for menigheden i dette område. I 1872 åbnede dog Sankt Pauls Kirke i Trinitatis Sogns nordlige distrikt og ti år tidligere havde Nørrebro, som også oprindeligt hørte til sognet, fået sin egen kirke Sankt Johannes Kirke.
På sydsiden af kirken ligger Trinitatis Kirkeplads, hvor der indtil 1851 lå en kirkegård. Den blev lukket, fordi man forbød begravelser i den indre by. På tegningen øverst på siden, ses pladsen tegnet af L. Both i 1749.
